注意事项

贴壁细胞参考：

一 ：收货后消毒静置待细胞全部稳定后拍照。弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

二 ：T25 瓶加入 0.25％EDTA 胰蛋白酶 1-2ml 于培养瓶中震荡混匀，如果属于贴壁不牢固的细胞很容易脱落的就培养箱外面消化震荡等脱落 90%以上终止消化，一般小于 1 分钟以内，甚至不加胰酶有部分贴壁非常不牢固的细胞也会自然震荡脱落。如果是贴壁牢固的细胞则置于 37℃培养箱中消化提高效率，每 40-50 秒拿出培养箱震荡帮助细胞脱落，如果脱落 90%以上则对应 3-6ml 含有 10%血清的完全培养基终止彻底，以防胰酶残留。如果贴壁非常牢固的细胞，脱落的比例比较低，也不超过 2 分钟后终止消化彻底，再加入 1ml 完全培养基让细胞缓冲后再过 2 分钟进行二次消化，反复分步消化以降低单次消化时长，减少刺激，保护细胞膜。或采用刮产刮细胞的方式处理也可以。总归原则是达到消化目的的同时减少细胞膜受到的损伤越小越好。

三 ：消化完成后轻轻吹匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。将细胞悬液按 1：2 的比例分到新 T25 瓶/6cm 培养皿中，添加 6-8ml 按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按 1:2~1:5 的比例进行。期间多的细胞一定保存多份细胞冻存管备种。

悬浮细胞参考：

大多数悬浮细胞对于环境比较敏感，建议一直维持高密度生长，一般情况下细胞密度维持在 1×10 5 到 1×10 6个/mL（不同细胞对密度要求不同）。如需分瓶可以将细胞悬液收集到离心管中 800-1000rpm，离心 5min，弃去上清，补加 1-2mL 培养液后重悬混匀后将细胞悬液按 1：2 的比例（首次可以 1:1 分瓶）分到新 T25 瓶中，添加5-6ml 按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按 1:2~1:4 的比例进行。大多数血液类相关的悬浮细胞受运输影响比较大，会出现一批死细胞，如果因此密度降低了，可以离心后转移至 T25 瓶中竖着培养，培养基添加 5ml 以提高总体密度，隔一天后观察密度可以的话再补液 3ml 完全培养基后 T25 瓶放倒，等沉淀稳定后观察细胞密度，持续添加培养基等密度上升足够传代为止。 运输形式 常温发货：收到后 T25 瓶消毒再放置培养箱静置 2-6 小时后观察密度和状态并拍照 2-3 张反馈给销售，密度达标就可以传代。前期传代比例 1:2，等再次长满后传代时建议冻存其中一整瓶成 1 个 1ml 冻存管，另外一瓶继续传代，反复冻存足量种子后才扩增做实验，以防突发情况引起断种。干冰发货：常规细胞发货冻存管 2 只，复苏 1 只，另外一只备用，第一个复苏不成功时严格按照厂家要求复苏第二个，均没有复苏成功的情况及时留存复苏照片通知销售处理售后问题。