该试剂盒的检测原理是5´-核苷酸核糖基的2´、3´碳原子都有羟基，这两个碳原子之间的键较弱，过碘酸可氧化使其断裂生成二醛化合物，后者与甲胺基生成化合物，该化合物在酸性条件下脱下磷酸基，测定该无机磷量，即得5´-核苷酸，无机磷与钼酸铵形成黄色的磷钼酸铵，随后还原剂把高价钼离子还原成低价钼离子，进而形成蓝色的钼蓝，在一定浓度范围蓝色深浅与磷含量成正比。

在660nm处检测吸光度，通过检查标准曲线获得磷含量，同时为了消除其他无机磷的干扰，测定未经过碘酸氧化的无机磷，予以扣除，即为准确的5´-核苷酸磷。