酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay ），简称ELISA，是以免疫学为基础，将抗原抗体特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来高敏感实验技术。

ELISA原理

免疫分析是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过检测结合产生的信号，对目标抗原或抗体进行定量或定性分析的方法。ELISA是免疫分析一种检测技术，它分为3部分组成：免疫识别、信号输出和数据处理。

ELISA步骤

将抗原或抗体包被在聚苯乙烯制成的96孔板上。加入待测样品后，目标抗原（例如疾病的蛋白质生物标记物、病毒、细菌等）会与包被的抗体特异性结合。随后，加入带有酶标记（例如辣根过氧化物酶HRP）、荧光或放射性标记的二抗进行检测。在直接法中，标记物直接连接到识别抗原的一抗上；而在间接法中，标记物连接到识别一抗的二抗上。最后，通过检测信号强度并与标准曲线比较，可以定量测定待测样品中目标抗原的浓度。

ELISA分类

根据免疫识别和信号输出方式不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法是比较常见的检测方法，接下来上海晶抗生物为大家详解解析其原理及步骤。

双抗体ELISA夹心法原理

双抗体夹心法利用两种针对不同表位的抗体来检测抗原。首先，将捕获抗体固定在ELISA板上，用于捕获待测抗原。然后，加入带有标记的检测抗体与结合的抗原结合。通过检测标记信号的强度，可以定量抗原的浓度。配对抗体的选择和验证至关重要，它们必须能够同时结合抗原的不同表位，才能确保实验的成功。

双抗体夹心法特点

双抗体夹心法主要用于检测具有至少两个表位的抗原。优点是灵敏度高、特异性强、操作简便。缺点是抗原必须具有多个抗体结合位点，且可能出现钩状效应。小分子抗原或半抗原通常需要采用其他ELISA方法进行检测。

双抗体夹心法步骤

①、捕获抗体通过多种分子间作用力（包括疏水作用、静电作用和范德华力）结合到聚苯乙烯ELISA板上。洗涤去除未结合的抗体后，使用封闭液（例如BSA或明胶）封闭板子上剩余的位点，以减少非特异性结合，从而降低背景信号并提高检测的灵敏度。

②、免疫识别。在进行免疫识别步骤时，首先将捕获抗体包被在聚苯乙烯ELISA板上。然后加入待测样品，并在37°C下孵育一段时间（通常为1-2小时，具体时间需根据实验优化）。在此期间，待测样品中的抗原会与包被在板上的捕获抗体特异性结合。高质量的捕获抗体对于实验的成功至关重要，它需要具备高特异性、高亲和力、高稳定性等特性，并且不受样品中其他成分的干扰。

③、洗板。洗去未结合的样品后，加入酶标二抗，并在37°C下孵育一段时间（例如1-2小时）。然后洗涤去除未结合的二抗。

④、酶标信号输出。加入HRP标记的二抗与结合的抗原反应，孵育一段时间后洗涤。然后加入TMB显色剂，并用终止液终止反应。通过测定吸光度并与标准曲线比较，可以确定抗原浓度。

上述是晶抗生物为大家分享的双抗体夹心法的原理和步骤，双抗体夹心法作为ELISA广泛使用方法，了解方法原理和步骤可以提高实验的准确性。如果您对双抗体夹心法还有疑问，欢迎前来咨询。